快捷

4、法同方法学验证（线）性试验

精密移取低浓度混合对照品溶液20、时测50、定医100μl和0.5、用橡1、胶中加剂2ml于10ml具塞刻度试管中，种添用甲醇稀释并定容，法同即得系列混合浓度标准曲线工作液。时测其中，定医1的用橡浓度为O.03、0.09、胶中加剂0.17、种添0.85、法同1.71、时测3.14μg／ml；2的定医浓度为0.01、0.03、0.05、0.25、0.51、1.01μg／ml；3的浓度分别为0.36、0.9l、1.81、9.06、18.10、36.20μg／ml；4的浓度分别为0.03、0.09、0.17、0.86、1.72、3.44μg／ml。将系列浓度标准曲线工作液按色谱柱TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为5mmol／L磷酸二氢钾溶液，B为乙腈：甲醇(9:1)，梯度洗脱(8min，A75％；8-12min，A75％-40％：12-25min，A40％：25-27min，A40％-75％；27L-35min，A75％)；流速1.0ml／min；柱温40℃；检测波长300nm；进样量20μl方法检测，以峰面积A为纵坐标，浓度c为横坐标，进行线性回归。取对照品混合溶液进一步稀释进样测定，计算LOD及LOQ，结果如表1所示。

（2）精密度和稳定性试验

精密移取低浓度混合对照品溶液1m1置10ml量瓶中，用甲醇稀释定容，按色谱柱TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为5mmol／L磷酸二氢钾溶液，B为乙腈：甲醇(9:1)，梯度洗脱(旺8min，A75％；8-12min，A75％-40％：12-25min，A40％：25-27min，A40％-75％；27L-35min，A75％)；流速1.0ml／min；柱温40℃；检测波长300nm；进样量20μl下方法测定，重复进样6次，记录峰面积，结果显示1、2、3、4峰面积的RSD（n=6)分别为0.48％、0.49％、0.59％、0.37％，仪器精密度良好。

精密移取低浓度混合对照品溶液20、100、1000μl置10ml量瓶内，用甲醇稀释并定容，即得低、中、高浓度稳定性工作液，分别于0、4、8、16、24h和2、3、4、5d时，按色谱柱TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为5mmol／L磷酸二氢钾溶液，B为乙腈：甲醇(9:1)，梯度洗脱(旺8min，A75％；8-12min，A75％-40％：12-25min，A40％：25-27min，A40％-75％；27L-35min，A75％)；流速1.0ml／min；柱温40℃；检测波长300nm；进样量20μl方法测定。按1、2、3、4的峰面积计算RSD。结果显示低浓度稳定性工作液24h内RSD(n=3)分别为3.97％、3.45％、0.97％、0.14％；中浓度稳定性工作液24h内RSD(n=3)分别为0.41％、0.59％、0.26％、0.27％；高浓度稳定性工作液24h内RSD(n=3)分别为0.56％、2.02％、0.66％、0.54％；低浓度稳定性工作液5d内RSD(n=3)分别为1.24％、0.93％、1.35％、0.97％；中浓度稳定性工作液5d内RSD(n=3)分别为0.52％、1.13％、0.64％、0.56％：高浓度稳定性工作液5d内RSD(n=3)分别为1.15、1.30％、1.04％、0.90％。供试液低、中、高浓度对照液日内、日间均稳定性良好。

（3）回收率试验

受控提取试验回收率：取胶塞约1g，剪成0.3cm×0.3cm小块，置于中硼硅玻璃瓶内(规格100m1)，精密加入高浓度混合对照品溶液20、40、60μl，摇匀，制得低、中、高浓度材料加标提取溶液，受控提取供试液的制备：取橡胶材料约1.0g，剪碎，置于中硼硅玻璃瓶内(规格100m1)，加入二氯甲烷40ml后密封，(16士5)℃超声波水浴提取30min，取出放冷，过滤，采用适量二氯甲烷荡洗容器，滤液及洗液置于100ml量瓶中，同法提取2次，合并滤液并定容，得材料提取液。受控提取供试液的前处理：取上述材料提取液2ml于10ml具塞刻度试管中，用甲醇稀释至4ml，即得受控提取供试液，同法制备空白溶液。

模拟提取供试液的制备：(1)胶塞：以模拟溶剂I～Ⅳ为提取溶剂，分别按每西林瓶10ml灌装，加待测胶塞，压铝盖，倒立放置，121℃高压灭菌lh，放冷至室温，将各提取液分别合并至烧杯内，得胶塞供试液I～Ⅳ，同法制备空白。(2)EPDM卡箍密封圈：以模拟溶剂I～Ⅳ为提取溶剂，将EPDM卡箍密封圈装入管道中，灌装，密封，60℃高温烘箱放置24h，取出放冷，得EPDM卡箍密封圈供试液I～Ⅳ，同法制备空白。模拟提取供试液的前处理：取上述模拟提取供试液I～Ⅲ各25ml，分别加入6mol／L盐酸溶液20、40、80μl，调至pH1.8～2-3，混匀。取甲醇、水各5ml依次活化固相萃取小柱，提取液以流速1.5～2ml／min通过固相萃取小柱，取水20m1淋洗，甲醇4ml洗脱，收集洗脱液于5ml具塞刻度试管，用甲醇定容，即得。取供试液Ⅳ10ml，加入6mol／L盐酸溶液100μl，调至pH1.2～1.5，加入氯化钠4g吸水，加入甲基叔丁基醚2ml，涡旋3min，取上清液于10ml具塞刻度试管中，萃取3次，合并上清液，40℃水浴，氮吹至0.5ml，甲醇定容至2m1，即得。对照品溶液：分别精密称取1、2、3、4对照品25.1、25.3、266.4、25.3mg各置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得对照品溶液。高浓度混合对照品溶液：分别移取对照品溶液0.6、1.0、0.6、0.6ml置10ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀后即得高浓度混合对照品溶液。低浓度混合对照品溶液：分别移取对照品溶液1.7、0.5、1.7、1.7ml置100ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀后即得低浓度混合对照品溶液。方法进样测定，记录峰面积，计算目标物在二氯甲烷中的平均回收率(以=3)，各目标物在二氯甲烷中的回收率良好，符合方法学验证要求。
 

模拟提取试验回收率：(1)取模拟溶剂Ⅰ～Ⅲ25m1，分别加入低浓度混合对照品溶液20、50、100μ1，摇匀，制得低、中、高浓度加标溶液。受控提取供试液的制备：取橡胶材料约1.0g，剪碎，置于中硼硅玻璃瓶内(规格100m1)，加入二氯甲烷40ml后密封，(16士5)℃超声波水浴提取30min，取出放冷，过滤，采用适量二氯甲烷荡洗容器，滤液及洗液置于100ml量瓶中，同法提取2次，合并滤液并定容，得材料提取液。

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